No es la primera vez que se trabaja con CRISPR/Cas12a para la detección de patógenos, experimentos previos utilizan este método para el diagnóstico de virus del papiloma humano (VPH) en muestras de pacientes teniendo resultados prometedores con una alta sensibilidad. El sistema consiste en la activación de la ssDNase de Cas12a combinado con la técnica de amplificación isotérmica, dando como resultado el método denominado reportero trans-CRISPR dirigido a endonucleasa de ADN (DETECTR).

El nuevo kit diagnóstico para el virus SARS-CoV-2 fue desarrollado en conjunto por el Broad Institute del MIT y Harvard en Cambridge, Massachusetts, la empresa que comercializará el kit es Sherlock Biosciences con sede también en Cambridge. La muestra se obtiene mediante un hisopo de nariz, boca o garganta, o líquido procedente de los pulmones. La empresa Biosciences asegura que se podrán obtener resultados en tan solo una hora.

Pero ¿cómo se desarrollo esta nueva técnica?, primero debemos entender que el virus contiene un material genómico de ARN de cadena sencilla, de sentido positivo, por ello se necesita realizar un ensayo de transcripción inversa simultanea y amplificación isotérmica utilizando amplificación mediada por asa (RT-LAMP). La técnica de RT-LAMP amplifica secuencias de un templado específico, con la utilización de oligos, a una temperatura constante, en un plazo no mayor a 40 minutos. Seguido de la detección de secuencias específicas del virus mediante CRISPR/Cas12a, una vez unida la enzima Cas12a a la secuencia blanco, esta se activa para poder cortar secuencias de ADN de cadena sencilla (ssDNA), dicha secuencia de ssDNA se encuentra unida a un reportero que nos avisa de la presencia del virus.

Para poder amplificar las secuencias específicas del virus, se diseñaron primer dirigidos a los genes E (envoltura) y N (nucleoproteína) del SARS-CoV-2, estas regiones son las ya reportadas para diagnóstico molecular por la Organización Mundial de la Salud (OMS) (región E) y el Centro de Control de Enfermedades (CDC) en EUA (región N2 en el gen N). Se determinó la especificidad de los ARN guías (gRNA) del sistema CRISPR/Cas12a y se determinó que el gRNA diseñado para la región N interacciona únicamente con el material genómico del virus SARS-CoV-2 y no con SARS-CoV, ni con un SARS de murciélago.

La visualización de la reacción de detección de Cas12a se logra mediante la utilización de una molécula reportera de FAM-Biotina y tiras de flujo laterales diseñadas para capturar ácidos nucleicos marcados. Las moléculas reporteras sin cortar se capturan en la primera línea de detección (línea de control), mientras que la actividad de corte indiscriminada por Cas12a genera una señal en la segunda línea de detección (línea de prueba). Los ensayos de detección realizados en el experimento muestran que el kit tiene una sensibilidad de hasta 10 copias virales por μl.

Los resultados del ensayo de DETECTR SARS-CoV-2 demuestran que se logró realizar una RT-LAMP a 62ºC durante 20 a 30 minutos y una reacción de detección con Cas12a a 37ºC durante 10 minutos. El ensayo puede ejecutarse en aproximadamente 30 a 40 minutos y visualizarse en una tira de flujo lateral. Algunas ventajas clave del kit DETECTR vs qRT-PCR incluyen la amplificación de señal isotérmica que evita la necesidad de utilizar termociclador, tiempo de respuesta rápido, especificidad de objetivo de nucleótido único, integración de tiras de flujo que son accesibles y fáciles de usar evitando la necesidad de un laboratorio con infraestructura compleja. Por último, los desarrolladores de este kit tienen previsto el desarrollo de cartuchos portátiles basados en micro-fluidos y reactivos liofilizados para facilitar la realización del ensayo, permitiendo el uso de pruebas fuera de un laboratorio de diagnóstico clínico, como aeropuertos, departamentos de emergencias locales y clínicas.

En definitiva, el desarrollo del kit basado en CRISPR/Cas12a promete ser un salvavidas para obtener diagnósticos oportunos y así evitar contagios por parte de personas asintomáticas o de síntomas leves que desconocen su estado ante este virus.

Referencias:

Guglielmi G. (2020). First CRISPR test for the coronavirus approved in the United States. Nature, 10.1038/d41586-020-01402-9. Advance online publication. https://doi.org/10.1038/d41586-020-01402-9

Broughton, J. P., Deng, X., Yu, G., Fasching, C. L., Servellita, V., Singh, J., Miao, X., Streithorst, J. A., Granados, A., Sotomayor-Gonzalez, A., Zorn, K., Gopez, A., Hsu, E., Gu, W., Miller, S., Pan, C. Y., Guevara, H., Wadford, D. A., Chen, J. S., & Chiu, C. Y. (2020). CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nature biotechnology, 10.1038/s41587-020-0513-4. Advance online publication. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0513-4

Imagen tomada de: CRISPR-Cas12a enables accurate disease diagnostics. 2020. Recuperado de: https://www.drugtargetreview.com/news/29760/crispr-cas12a-disease-diagnostics/