Biologia Molecular Mexico

Los sistemas CRISPR-Cas representan una forma sofisticada de inmunidad adaptativa en bacterias y arqueas, con mecanismos de ARN guía que han revolucionado la ingeniería genómica. Mientras que los orígenes de los sistemas de direccionamiento de ADN como Cas9 y Cas12 se han rastreado hasta elementos móviles como los transposones, la historia evolutiva de los sistemas CRISPR que atacan ARN, como Cas13, había permanecido un tanto oscura, principalmente debido a la extrema divergencia de secuencias de sus componentes. Un estudio publicado en Cell por Shai Zilberzwige-Tal, Feng Zhang y colaboradores [1], utiliza un enfoque integrador de bioinformática estructural y caracterización bioquímica para iluminar los orígenes de Cas13, revelando una sorprendente conexión con antiguos sistemas de defensa toxina-antitoxina (TA).

El desafío para rastrear ancestros de Cas13 radica en que las comparaciones basadas únicamente en secuencia son insuficientes para detectar homólogos remotos. Los investigadores superaron esto combinando búsquedas de secuencia con análisis estructurales predictivos (usando AlphaFold2) y comparaciones estructurales (DALI). Esta estrategia híbrida les permitió identificar las proteínas HEPN (un tipo de nucleasa de ARN) estructuralmente más relacionadas con Cas13 dentro de la vasta superfamilia HEPN.

Sorprendentemente, los parientes más cercanos identificados no eran sistemas CRISPR, sino una familia de proteínas llamada AbiF, previamente asociada a mecanismos de “infección abortiva” (una forma de defensa celular que induce la muerte o dormancia de la célula infectada para prevenir la propagación viral) pero cuyo mecanismo exacto era desconocido. El estudio revela la verdadera naturaleza de AbiF: funciona como un sistema TA de tipo III. En estos sistemas, una proteína “toxina” (en este caso, la RNasa AbiF) es neutralizada por una molécula de ARN no codificante (ncRNA) “antitoxina” (AbiFr), transcrita desde el mismo locus genético.

Mediante una elegante combinación de secuenciación de ARN, ensayos bioquímicos y criomicroscopía electrónica (cryo-EM), los autores demostraron que la proteína AbiF es una RNasa activa que es inhibida directamente por su ncRNA AbiFr cognado. La estructura cryo-EM del complejo AbiF-AbiFr reveló cómo el ncRNA, tras ser procesado por la propia AbiF, se pliega en una estructura específica con horquillas y bucles que se inserta y bloquea físicamente el sitio activo de la RNasa toxina. Este es el primer ejemplo estructural de un sistema TA tipo III procariota canónico.

El estudio no se detuvo ahí. Identificaron y caracterizaron bioquímicamente una forma miniatura de Cas13 (previamente anotada como c13c1 y aquí clasificada como Cas13e), que parece ser un intermediario evolutivo clave. Cas13e es notable porque posee características duales: aún conserva una actividad RNasa basal (similar a la toxina AbiF) que puede ser inhibida por su ARN asociado (reminiscencia del componente antitoxina), pero también exhibe una actividad RNasa colateral (inespecífica) que es activada por el reconocimiento de un ARN diana específico guiado por un ARN CRISPR (crRNA), una característica definitoria de los efectores Cas13.

Basándose en análisis filogenéticos y estructurales comparativos detallados, los autores proponen una ruta evolutiva plausible desde AbiF hasta los complejos Cas13 actuales:

1. El gen AbiF ancestral probablemente se duplicó, dando lugar a una proteína con dos dominios HEPN.
2. Esta proteína perdió gradualmente su dependencia del ncRNA antitoxina co-transcrito.
3. Adquirió la capacidad de interactuar con ARN guía CRISPR (crRNA) derivados de arrays CRISPR cercanos. Esto implicó cambios estructurales cruciales, como la inserción de dominios de unión a crRNA (similares a REC) y dominios helicoidales adicionales.
4. Esta nueva interacción permitió la evolución de la actividad RNasa guiada por ARN, dando lugar a formas intermedias como Cas13e.
5. Posteriores inserciones de dominios y refinamientos estructurales llevaron a la diversidad y complejidad de los subtipos Cas13 conocidos (Cas13a, b, c, d), optimizando el reconocimiento del dúplex crRNA-ARN diana y la activación de la nucleasa.

En conclusión, este trabajo revela, magistralmente, el origen evolutivo de los sistemas CRISPR-Cas13 dirigidos a ARN. Demuestra cómo una compleja maquinaria guiada por ARN pudo evolucionar a partir de un sistema de defensa mucho más simple, no guiado, basado en la interacción toxina-antitoxina proteína-ARN. Este hallazgo no solo resuelve un importante enigma evolutivo, contrastando con el origen en transposones de Cas9/Cas12, sino que también amplía nuestra comprensión sobre la diversidad funcional de los dominios HEPN y los intrincados mecanismos moleculares que subyacen a la inmunidad microbiana.

Referencia:

[1] Zilberzwige-Tal S, Altae-Tran H, Kannan S, Wilkinson ME, Vo SC, Strebinger D, Edmonds KK, Yao CJ, Mears KS, Shmakov SA, Makarova KS, Macrae RK, Koonin EV, Zhang F. Reprogrammable RNA-targeting CRISPR systems evolved from RNA toxin-antitoxins. Cell. 2025 Apr 3;188(7):1925-1940.e20. doi: 10.1016/j.cell.2025.01.034.