Biologia Molecular Mexico

La tecnología CRISPR ha revolucionado la forma en que estudiamos los genes, no solamente para modificar ratones y lobos para que parezcan organismos extintos. Los “cribados” o screens CRISPR a gran escala, donde se modifican miles de genes a la vez, son herramientas increíblemente poderosas para descubrir qué genes son cruciales para procesos como el crecimiento celular, la respuesta a fármacos o el desarrollo de enfermedades como el cáncer. Sin embargo, una vez que un screen identifica cientos de “genes candidatos” o “hits”, surge un desafío: confirmar que esos resultados son reales y relevantes, ya que validar tantos genes es un reto enorme y muy costoso.

Adicionalmente, validar estos “hits” es un paso crítico pero a menudo lento y laborioso. Ahora, investigadores han desarrollado y validado un método ingenioso, rápido y robusto llamado CelFi (por Cellular Fitness), diseñado específicamente para acelerar esta fase crucial de validación.

¿Cómo Funciona CelFi? Siguiendo la Huella de la Edición

Imagina que un screen CRISPR sugiere que desactivar el Gen X podría detener el crecimiento de células cancerosas. ¿Cómo lo confirmamos rápidamente? Aquí entra CelFi:

1. Edición Dirigida: Se utiliza CRISPR-Cas9 para cortar específicamente el Gen X en un grupo de células en el laboratorio.
2. Reparación Imperfecta: Las células reparan estos cortes, pero a menudo cometen pequeños errores, insertando o eliminando algunas letras del código genético (estas “cicatrices” se llaman “indels”).
3. Indels “Rompientes”: Algunos indels (llamados “fuera de marco” u Out-of-Frame, OoF) suelen provocar que la proteína codificada por el Gen X no se produzca correctamente o no funcione (es decir, logran el “knockout” deseado). Otros indels pueden dejar el gen intacto o parcialmente funcional.
4. Seguimiento en el Tiempo: Se toma una muestra de las células poco después de la edición (ej. día 3) y se analiza mediante secuenciación qué porcentaje de las células tienen indels OoF. Luego, se deja que las células crezcan durante un tiempo (ej. hasta el día 21) y se vuelve a medir.
5. La Clave: El Cambio en la Proporción: Si el Gen X es realmente importante para la supervivencia celular, las células donde este gen fue inactivado (las que tienen indels OoF) crecerán menos o morirán. Como resultado, la proporción de indels OoF disminuirá drásticamente entre el día 3 y el día 21. Si, por el contrario, inactivar el Gen X diera una ventaja (quizás resistencia a un fármaco), la proporción de indels OoF aumentaría.

¿Por Qué CelFi es Útil?

El método CelFi, descrito en la revista Scientific Reports, ofrece varias ventajas:

• Rapidez: Permite validar el efecto de un gen sobre la “aptitud celular” (cellular fitness) en cuestión de semanas, mucho más rápido que otros enfoques.
• Robustez: Funciona bien incluso si la eficiencia inicial de la edición CRISPR varía entre experimentos o si las células tienen diferente número de copias del gen. Mide el cambio relativo a lo largo del tiempo.
• Versatilidad: No solo valida “hits” de screens, sino que también puede usarse para probar nuevas hipótesis sobre la función de un gen, estudiar dependencias genéticas específicas de un tipo celular, o incluso evaluar cómo la desactivación de un gen afecta la respuesta a un tratamiento farmacológico (como demostraron en el estudio con la molécula DHA).

• Identifica Discrepancias: Los autores mostraron cómo CelFi podía identificar tanto “falsos negativos” (genes que parecían no importantes en los screens iniciales, pero sí lo eran) como “falsos positivos” (genes que parecían importantes, pero CelFi demostró que no tenían un gran efecto en la aptitud celular).

Impacto en la Investigación

Al proporcionar una forma sencilla y fiable de validar rápidamente los resultados de los complejos screens CRISPR, CelFi actúa como un puente crucial entre el descubrimiento a gran escala y la investigación funcional detallada, sin la necesidad de obtener clonas puras para primero validar que tienen la mutación para luego hacer ensayos de viabilidad y funcionalidad. Permite a los científicos enfocar sus esfuerzos en los genes candidatos más prometedores, acelerando la comprensión de la biología celular y el desarrollo de nuevas dianas terapéuticas.

En resumen, CelFi es una adición valiosa a la caja de herramientas del biólogo molecular, simplificando un paso esencial en el camino para descifrar el complejo manual de instrucciones de la vida escrito en nuestros genes.

Referencia: Loughran, A.J., Narina, S., Klein, J. et al. Rapid and robust validation of pooled CRISPR knockout screens using CelFi. Sci Rep 15, 13358 (2025). DOI: 10.1038/s41598-025-96095-3